偏肺病毒(hMPV)熒光PCR核酸檢測試劑盒

禽戊型肝炎病毒(Avian Hepatitis E Virus，aHEV)是肉種雞和蛋雞的一種疾病，該病感染可能表現亞臨床癥狀，伴有較低的死亡率和產蛋率下降，會引起肝脾腫大綜合征和大肝大脾病等，因此靈敏快捷的診斷產品具有重要的意義。本產品基于PCR原理開發。它具有下列特點：

一站式，用于不需要單獨準備每種成分，包括引物和對照。
根據禽戊型肝炎病毒的保守基因序列設計的引物，具有良好的特異性。
基于染料法qRT-PCR檢測，靈敏度比常規RT-PCR高10-100倍，可以達到至少1000拷貝/反應。
使用一管式qRT-PCR技術，RT和PCR兩步在一個試管內完成，不需要中間轉移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。
本產品足夠50次30μL體系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于臨床。

成  份                                                         十孔盒包裝

2×qRT-PCR 緩沖液                                  500 μL（棕色管）

10×qRT-PCR酶混合液                               100 μL（紅蓋）

 ROX染料I                                                 50 μL（棕色管）

ROX染料II                                                  50 μL（棕色管）

熒光PCR模板稀釋液                             1mL（亮黃蓋）

禽戊型肝炎病毒RT-PCR引物混合液              100 μL（白蓋）

禽戊型肝炎病毒RT-PCR陽性對照

（1×10E8拷貝/μL）                                     50 μL（黃蓋）

核酸釋放劑試用裝                               20次（1mL，綠蓋）

低溫運輸，-20℃保存，保存期限為12個月。陽性對照需要因易污染其他成分需要單獨放置。本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供DNA段作為陽性對照。

樣品RNA

一、稀釋陽性對照（以10E2-10E7這6個10倍稀釋度為例。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原。

標記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。用帶芯槍頭分別加入45 μL 熒光PCR模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。
在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。重復上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。

二、樣品RNA的制備

如果有N個樣品，必須設置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0μL上步制備的陽性對照梯度稀釋液中的第4號（濃度為1×10E4拷貝/μL，10μL相當于1萬拷貝）再加上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）。可以用水作為制備的陰性對照。
用自選方法純化N+2個樣品的RNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒RNA提取試劑盒兼容。本試劑盒免費贈送20次免RNA提取的核酸釋放劑試用裝，

三、設置RT-PCR反應（20μL體系，在樣品制備室進行）

如果做定量分析并且只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復，則標記N+4個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于PCR陽性對照（用第4號陽性對照稀釋液做模板）。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把6個標曲反應縮減成1個，其余不變。
在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子后后加）：

成分                   N+2個制備所得樣品            RT-PCR陰性對照             RT-PCR陽性對照（2-7管）

2×qRT-PCR               10μL                                     10μL                               各10μL

緩沖液

口蹄疫病毒RT-PCR      2μL                                        2μL                               各2μL

引物混合物

50×ROX (見注)           0.4μL                                      0.4μL                             各0.4μL

樣品制備所得RNA模板    5.6μL                                   不加                                不加

（來于第8步）

稀釋所得6個陽性對照       不加                                    不加                         各5.6μL（2號樣到2

（來于第6步）                                                                                           號管，3號樣到3號管…）

10×qRT-PCR                   2μL                                      2μL                                 2μL

酶混合液

注:需使用ROX染料I的機型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。

需使用ROX染料II的機型：：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的Chromo4、Opticon（II）Corbett Rotor Gene 3000。

不需要使用ROX的機型：Thermal Cycle Dice Real Time System， LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene 3000、RotorGene 6000。

上機后按下面參數進行RT-PCR（參數可能會因儀器不同而需優化）。

如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復一次。重復實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。

偏肺病毒(hMPV)熒光PCR核酸檢測試劑盒